Consorcio junto con los Drs. T. Nishigaki y C. Treviño

Entender la reproducción impacta no sólo a la fisiología y la salud humana, si no a la ganadería y la pesca. El diálogo entre gametos es clave para que ocurra la fecundación e involucra la regulación de su permeabilidad iónica. Los canales iónicos participan importantemente en la movilidad, maduración e inducción de la reacción acrosomal (RA) del espermatozoide. El espermatozoide es sujeto de renovado interés en la fisiología celular por su fundamental función. Entender los parámetros que afectan su movilidad es clave para comprender como ocurre la fecundación. La capa de gelatina que rodea al óvulo de erizos de mar Strongylocentrotus purpuratus contiene al speract, un decapéptido que modula la movilidad del espermatozoide. Actualmente se acepta que la unión del speract a su receptor(es) activa una guanilato ciclasa (GC) transitoriamente. El aumento en el GMPc activa canales de K regulados por GMPc que hacen más negativo el potencial de membrana (Em) del espermatozoide. Esta hiperpolarización temporal estimula a: un intercambiador Na /Ca2 que mantiene baja la concentración intracelular de Ca2 ([Ca2 ]i), un intercambio Na /H , la adenilato ciclasa (AC) y posiblemente un canal catiónico llamado SpHCN. Posteriormente el Em se repolariza y luego se depolariza resultando en aumentos en: el pH intracelular (pHi), la [Ca2 ]i, el AMPc y la [Na ]i. Se sabe que la [Ca2 ]i está íntimamente relacionada con la forma en la que bate el flagelo.

Nosotros mostramos por primera vez que el speract induce fluctuaciones en el [Ca2 ]i en espermatozoides individuales. Propusimos que estas fluctuaciones regulan como nada el espermatozoide. Nuestro sistema experimental mejorado de adquisición y análisis de imágenes para medir [Ca2 ]i en espermatozoides individuales nadando nos permite registrar simultáneamente su trayectoria, la forma del flagelo y su concentración local de [Ca2 ]i. Hasta hace poco Arbacia punctulata era la única especie de erizo de mar en la que se había demostrado quimiotaxis. Aunque los espermatozoides de S. purpuratus responden al speract regulando su patrón de movimiento en forma parecida, no experimentan quimiotaxis bajo las mismas condiciones. Recientemente comparamos las respuestas a un gradiente de speract de espermatozoides de S. purpuratus y Lytechinus pictus, que también responden a este decapéptido. Encontramos que solo los espermatozoides de L. pictus responden con incrementos en la [Ca2 ]i regulados en tiempo y espacio que desencadenan una respuesta quimotáctica. Mientras los espermatozoides de L. pictus selectivamente disparan fluctuaciones de Ca2 cuando nadan en un gradiente descendente pronunciado, los de S. purpuratus disparan fluctuaciones al azar independientemente del sentido del gradiente de speract. El acoplamiento del disparo de fluctuaciones de Ca2 y vueltas pronunciadas a la polaridad del gradiente del quimoatractante es una propiedad esencial de la quimotaxis en el espermatozoide del erizo de mar y quizá de los espermatozoides en general. Entender como el Ca2 regula el batido flagelar es importante no solo para la fecundación ya que ahora se sabe que la mayoría de los tipos celulares tiene al menos un cilio o un flagelo cuya estructura está muy conservada y su función clave para procesos de diferenciación y se–alización. En el ratón y algunos otros mamíferos, la capacitación, un proceso de maduración del espermatozoide que ocurre en el tracto genital femenino que lo prepara para fecundar exitosamente al óvulo, aumenta el [Ca2 ]i, el pHi, el potencial de membrana se hiperpolariza y varias proteínas se fosforilan en tirosinas. Varios canales parecen contribuir a dicha hiperpolarización. Usando herramientas moleculares, inmunológicas y funcionales hemos documentado la presencia en el espermatozoide de ratón y humano de nuevos miembros de la familia de canales TRP, TRPV1 y TRPM8 y estamos explorando su papel fisiológico. Sabemos ahora que el TRPM8 podría participar en la RA del espermatozoide de ratón y no en la de humano. Hemos documentado que el Cl- es importante para la capacitación, la fosforilación en tirosinas, la RA y la fecundación. Hemos reportado la presencia de un canal de Cl- CFTR en los espermatozoides de estas especies y que este canal parece regular a los ENaCs. La fosforilación que ocurre durante la capacitación depende de aumentos en la concentración de AMPc, sintetizada por una adenilato ciclasa soluble dependiente de HCO3-. El aumento en la concentración de HCO3- y del pHi son muy importantes para completar la capacitación. Las concentraciones intracelulares de Cl- ([Cl-]i) y HCO3- están íntimamente relacionadas ya que el transporte de estos iones en muchos casos es interdependiente. Durante la capacitación aumenta [Cl-]i y estamos estudiando a los intercambiadores de la familia Slc26 dado que en tejidos como el páncreas y el ri–ón interaccionan tanto con el CFTR como con el ENaC regulando la homeostasis del Cl- y del HCO3-. Quizá hay un mecanismo de regulación similar en el espermatozoide ya que los canales CFTR y ENaC están en esta célula. Hemos detectado por Western Blot a los intercambiadores Slc26a3 y Slc26a6 en extractos de espermatozoides de ratón y mediante inmunocitoquímica vimos que se localizan en la pieza media, co-localizando con los canales ENaC y CFTR. Usando una estrategia recientemente publicada en la que se sella un electrodo de patch clamp en la Ògota citoplásmicaÓ, es posible registrar corrientes macroscópicas en espermatozoides inmaduros. A pesar de ser una estructura residual que se elimina, la gota citoplásmica está en continuidad eléctrica con el espermatozoide completo. Usando esta nueva estrategia y expresión heteróloga del Slo3 obtuvimos evidencia de la presencia funcional de este canal en el espermatozoide de ratón.

El inductor natural de la reacción acrosomal (RA) es la ZP3, una glicoproteína de la matriz externa del óvulo que activa, entre otras cosas, una entrada de Ca2 dependiente de Ca2 externo que es necesaria para que ocurra la RA. Esta entrada de Ca2 tiene al menos dos componentes, uno transitorio (mseg) y el otro sostenido (min). Existe evidencia de que la entrada sostenida de Ca2 esta mediada por canales operados por pozas internas (SOCs). El bloqueo de los SOCs inhibe la RA. Sin embargo, el mecanismo y la identidad molecular de estos canales no están bien definidos. Ahora sabemos que los SOCs están compuestos por dos familias de proteínas transmembranales, STIM (con dos miembros) y Orai (con tres miembros). STIM1 actúa como un sensor de Ca2 del retículo endoplásmico (RE) y/o como activador de Orai, el cual constituye el propio canal que, al activarse, permiten una entrada altamente selectiva a Ca2 , no activada por voltaje, denominada ICRAC (release activated calcium current) en células no excitables. En el espermatozoide de ratón detectamos STIM1, STIM2, Orai1 mediante RT-PCR en células espermatogénicas y mediante Western Blot confirmamos la presencia de las proteínas STIM1, STIM2 y Orai3 e iniciamos estudios de su localización subcelular.