Instituto de Biotecnologia UNAM

Grupo del Dr. Takuya Nishigaki

Fisiología Molecular de Espermatozoide y Biosensor fluorescente.

Consorcio junto con los Drs. C. Treviño y A. Darszón

Fisiología Molecular de Espermatozoide y Biosensor fluorescente


Introducción

El batido flagelar del espermatozoide es una función fundamental debido a que cualquier defecto en el movimiento flagelar resulta en una deficiencia en la fertilidad. La forma y la frecuencia del batido flagelar cambian dinámicamente durante el proceso de fecundación. En mamíferos, el movimiento flagelar del espermatozoide inicia al momento de la eyaculación. En un principio, la forma del batido flagelar es simétrica con una amplitud baja y con una frecuencia alta. Este modo se llama 'activado' y produce un nado progresivo en un medio no viscoso (Fig. 1A arriba). En contraste, existe un modo vigoroso del batido flagelar llamado 'hiperactivación', el cual se observa en la ámpula del oviducto, donde ocurre la fecundación. El espermatozoide hiperactivado muestra un batido flagelar asimétrico, con una amplitud alta y una frecuencia reducida y no nada progresivamente en un medio de baja viscosidad (Fig. 1A abajo). Sin embargo, en un medio viscoso (y viscoelástico), el mismo espermatozoide muestra un nado progresivo (Fig. 1B). Se considera que la hiperactivación permite que el espermatozoide: 1) se despegue del epitelio del Istmo (un reservorio de los espermatozoide en el oviducto), 2) avance progresivamente en un ambiente viscoso (y visco elástico) y penetre eficientemente la matriz extracelular del óvulo como la capa de células cúmulus y la zona pelúcida (Fig. 1B)

Figura 1. Movimiento de hiperactivación (A abajo) y su papel fisiológico en la fecundación (B)
Figura 1. Movimiento de hiperactivación (A abajo) y su papel fisiológico en la fecundación (B).



Líneas de Investigación


Fisiología Molecular del Espermatozoide

Estamos trabajando para entender el mecanismo molecular que controla el batido flagelar del espermatozoide (hiperactivación), enfocándonos en los siguientes 4 parámetros fisiológicos incluyendo a las proteínas responsables de esos parámetros:

  1. El Ca2+ intracelular, el cual depende principalmente del canal CatSper (canal de Ca2+ específico del espermatozoide)
  2. El pH, considerando al sNHE (intercambiador Na+/H+ específico del espermatozoide) y canal de H+ dependiente de voltaje.
  3. El AMP cíclico, cuya síntesis depende de la sAC (adenilato ciclasa soluble)
  4. El potencial de membrana plasmática, el cual podría modularse por los canales tetraKCNG/CNGK y Slo3 (canales de K+)

Con respecto al sNHE, estamos trabajando con el dominio de unión a nucleótidos cíclicos (CNBD) que funciona como un switch molecular, el cual se encuentra presente en varias proteínas dependientes de AMP cíclico incluyendo el sNHE. Hemos desarrollado un ensayo de unión al CNBD con base a FRET (Transferencia de Energía por Resonancia entre Fluoróforos) (Fig. 2).

Figura 2. Esquema de un ensayo de FRET entre el CNBD-CFP y un análogo fluorescente del AMPc. CFP es una proteína fluorescente de color cian.
Figura 2. Esquema de un ensayo de FRET entre el CNBD-CFP y un análogo fluorescente del AMPc. CFP es una proteína fluorescente de color cian.


Biosensor fluorescente

Nuestro ensayo de unión basado en FRET nos permite caracterizar la interacción entre un dominio y un ligando, sin la necesidad de separar mecánicamente a las moléculas libres (no unidas) y al complejo, por lo que se ahorra tiempo y trabajo si lo comparamos con los métodos convencionales como ensayos de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) y Pull-down assay.

Por otro lado, existen algunos ensayos de unión sin el proceso de la separación mecánica como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC por sus siglas en inglés) y la anisotropía de fluorescencia. Sin embargo, estos ensayos requieren equipos especiales (nuestro instituto no cuenta con un equipo para ITC). Por lo anterior, nuestro ensayo con base en FRET es más sencillo, versátil y lo podemos realizar con un espectrofluorómetro y/o un lector de placas convencionales.

Considerando la ventaja del ensayo de unión basado en FRET usando proteínas fluorescentes (Fig. 3), estamos trabajando en el desarrollo de biosensores fluorescentes para disruptores endócrinos.

Figura 3. Ventaja de utilizar proteínas fluorescentes en la producción y purificación de proteínas recombinantes.
Figura 3. Ventaja de utilizar proteínas fluorescentes en la producción y purificación de proteínas recombinantes.

Dr. Takuya Nishigaki
Investigador
Tutor de Maestría y Doctorado
Dr. Ignacio Lopez
Investigador
Tutor de Maestría y Doctorado
M.C. Yoloxochitl Sanchez
Técnico Académico
Bryan Alexis Alvarado
Estudiante
Biol. César Arcos
Estudiante
Ing. Andrea Zacnite Cuevas
Estudiante
Valery Itzxchel Escobedo
Estudiante
M.C. Sandra Hernández
Estudiante
Columba Alejandra López
Estudiante
Dr. Francisco Romero
Estudiante
Miguel A. Trujillo
Auxiliar de Laboratorio


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