Instituto de Biotecnologia UNAM

Manual Operativo LPRT

MANUAL OPERATIVO LPRT
  • SERVICIOS MISCELANEOS
    1. Superovulación
    2. Hembras pseudopreñadas
    3. Colecta de embriones en etapas de preimplantación
    4. Cariotipificación y detección de Mycoplasma sp
    5. Genotipificación por PCR
    6. Cirugías: Ovariectomia, vasectomia y transferencia de embriones
  • COSTOS
  • HORARIO DE SERVICIO
  • PROCEDIMIENTOS Y CONDICIONES DE SERVICIO

    • COMO SOLICITAR UN SERVICIO
    • PRIORIZACIÓN
    • LINEAMIENTOS DE ENTREGA
    • FORMATO DE SOLICITUD DE SERVICIO

    MISIÓN

    La genómica comparativa se ha enriquecido con la secuenciación del genoma del humano, del ratón y otras especies. Cada vez es más evidente que comparando el genoma humano con el de otros organismos se puede entender mejor y en menor tiempo la estructura y función de los genes humanos. En este contexto el ratón ocupa un lugar muy especial pues a través de su historia se han identificado cepas que representan modelos ideales de varias enfermedades humanas; además, una comparación gruesa muestra que hasta un 90% del genoma de ratón se puede alinear con el genoma humano, en donde se puede observar que el orden de los genes se conserva en largos trechos.

    En las últimas décadas, el desarrollo de las tecnología que permiten manipular al ácido desoxirribonucleico (ADN) ha permitido que los científicos identifiquen y aíslen genes que llevan información codificada para características específicas del organismo. Ese material genético ahora se puede modificar y replicar en forma indefinida. Genes modificados se pueden introducir en el genoma de células embrionarias tal que el nuevo material genético se transmita a su progenie. Los animales que llevan estos genes y que se espera muestren nuevas características se les conoce como "animales transgénicos".

    La Unidad de Producción de Roedores Transgénicos (LPRT) surgió como una iniciativa por parte de varios investigadores para poder realizar investigación científica en el área de genómica del ratón, en México.

    La misión del LPRT es apoyar la investigación donde los ratones transgénicos o las manipulaciones en las células troncales embriónicas resultan ser una herramienta poderosa para lograr sus objetivos. Una vez funcionando, la LPRT ofrecerá asesoría en el diseño de roedores modificados genéticamente y el servicio técnico para su producción.

    OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN

    LA LPRT comenzó a funcionar a partir de Junio del 2009 y tiene como objetivo principal el ofrecer un servicio de producción eficiente de roedores modificados genéticamente para usarse como modelos animales para la investigación en la UNAM, y en otras instituciones académicas del país.

    Los animales transgénicos representan una de las herramientas más valiosas de las ciencias biológicas actuales, especialmente las ciencias genómicas. La primera producción exitosa de ratones transgénicos usando microinyección se reportó en 1980; desde entonces, los animales transgénicos han impactado varias disciplinas de la medicina como la inmunología, cancerología, genética, cardiología, la neurología, entre otras. La introducción de genes "foráneos" (ya sean nuevos o modificados) en el genoma de embriones de mamífero para crear animales transgénicos es uno de los adelantos más valiosos de las últimas dos décadas en el área de la biotecnología

    En México, esta unidad sería la primera en su tipo. La posibilidad de contar con herramientas moleculares y celulares para la manipulación del genoma del ratón en forma accesible deberá representar una oportunidad para la comunidad científica del país, al poder desarrollar proyectos con tecnología de frontera esencial para el entendimiento de la función de los genes.

    PERSONAL ADSCRITO A LA LPRT

    Dr. Leandro David Hernández García.
    Técnico y jefe operativo de la LPRT.

    COMITÉ TÉCNICO

    Dra. Hilda Lomelí Buyoli (IBT)

    Dra. Diana Escalante-Alcalde (IFC).

    Dra. Leonor Pérez Martínez (IBT)

    Dr. Gustavo Pedraza Alva (IBT)

    Dr. Luis Covarrubias Robles ( IBT, Responsable Académico)

    INFRAESTRUCTURA GENERAL

    La LPRT esta localizada dentro de las instalaciones del bioterio, en Instituto de Biotecnología de la UNAM. Al interior del bioterio, está instalada en dos salas, las salas E5 y E6. La sala E5 está compartida con animales propios del bioterio. En ella se encuentra la infraestructura destinada al mantenimiento y manipulación de las líneas de roedores propias de la LPRT, y que incluye:

    • 1 Anaquel ventilado (Rair Isosistem>; con capacidad para el mantenimiento de 720 ratones).
    • 1 Mesa aséptica (Allerzone);para el cambio de cajas que contienen a los ratones).
    • 1 Microscopio estereoscópico (SMZ1500. Nikon; empleado en cirugías así como para la obtención y manipulación de embriones murinos en estado preimplantación).
    • 1 Sistema de almacenamiento criogénico (Daigger)
    La sala E6 esta dedicada al cultivo celular y la micromanipulación de embriones murinos, y cuenta con:
    • 1 Campana de flujo laminar (Nuaire).
    • 1 Incubadora de CO2 (Nuaire).
    • 1 Mesa antivibratoria.
    • 1 Microscopio invertido con sistema de micromanipulación (Zeiss).
    • 1 Puller y una microforja (Sutter; para la elaboración de micropipetas).
    • 1 Sistema de microinyección ¨piezo¨(Primetech).
    • 1 Electroporador (Biorad).
    • 1 Congelador (Sanyo).
    • 1 Refrigerador (Sanyo).

    SERVICIOS


    ASESORIA


    La LPRT proveerá asesoría a los usuarios que así lo deseen en materia de transgénesis murina. Los usuarios son bienvenidos para discutir varios temas como son: microinyección a pronúcleos, ¨gene targeting¨, construcción de vectores, cultivo de células troncales embriónicas, genotipificación, mantenimiento de roedores, tiempos de entrega y en los servicios que en general presta la LPRT. Para la asesoría o discusión es necesario concertar una cita con el técnico encargado de la LPRT.

    En particular, se prestará asesoría para el diseño y construcción de los vectores a usarse en el procedimiento de transgénesis, con énfasis en aquello usuarios que están decididos a solicitar el servicio. La producción de la construcción será responsabilidad del usuario.

    GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS

    La LPRT ofrece la generación de ratones transgénicos empleando células troncales embriónicas. El otro método, que es la microinyección al pronúcleo de ovocitos esta por estandarizarse y esperamos contar, en un futuro cercano, con este otro servicio. En el siguiente esquema se muestran las diferentes etapas para generar un ratón transgénico utilizando células troncales embriónicas, así como los pasos donde la LPRT participa. En este esquema se indican los pasos donde el usuario puede decidir la entrega del servicio.

    CULTIVO DE CELULAS TRONCALES EMBRIÓNICAS

    1. Cultivo celular.
    2. Generación de líneas transgénicas.

    La LPRT cuenta con las siguientes líneas de células troncales embriónicas, misma que pone a disposición del usuario:


    Línea

    Fondo Genético

    Características

    R1

    Híbrido 129SvJ x 129S1


    G4

    Híbrido 129S6 x C57BL6


    C2

    C57BL/6


    Z/RED

    129S6/B6

    Celulas RFP+ específica

    B5/EGFP

    Híbrido 129SvJ x 129S1

    Celulas GFP+ constitutiva

    RFP

    Híbrido 129S6 x C57BL6

    Celulas RFP+ constitutiva

    Z/EG-26

    Híbrido 129SvJ x 129S1


    AB2.2

    129S6/B6


    A) Cultivo celular

    El servicio que se ofrece en el cultivo básico de células troncales embriónicas incluye: amplificación, mantenimiento y congelación; el cultivo se realiza sobre células alimentadoras primarias (fibroblastos embrionarios) o con la línea de fibroblastos STO. Si el usuario otorga su propia línea de células troncales, se realizarán estudios para detectar Mycoplasmaspcon el fin de que puedan entrar a las instalaciones de la unidad.

    B) Generación de líneas transgénicas.

    El usuario será responsable de generar la construcción de ADN recombinante y de entregarla en estado linearizado. La LPRT se encargará de la limpieza del mismo para evitar que éste sea un factor que influencie la eficiencia de electroporación. La LPRT será responsable de la electroporación, selección, levantamiento de colonias, crecimiento de las colonias en cajas de cultivo de 96 pozos, en cajas de 24 pozos y finalmente de la congelación. El análisis de genotipificación y/o expresión del transgén en las colonias corre a cargo del usuario.

    GENERACIÓN DE QUIMERAS

    La LPRT esta en disposición de ofrecer el servicio de generación de quimeras por agregación de células troncales embriónicas con embriones en estado de mórula, o por la microinyección de las mismas en embriones en etapa de blastocisto. Algunos investigadores han observado que con ciertas líneas de células troncales embriónicas aparece un mayor grado de quimerismo en ratones dependiendo del método empleado para su generación. El usuario pondrá a disposición la línea celular a transferir (ésta podría haberse generado en la presente unidad) y la LPRT entregará los ratones quiméricos resultantes al momento del destete. Es importante realizar estudios de cariotipificación y de contaminación para las diferentes especies de >Mycoplasma sp en la línea celular a transferir para descartar estos factores en el grado de quimerismo de los animales. La LPRT cuenta con estos servicios de diagnóstico, mismos que pone al alcance del usuario (ver abajo).

    TRANSMISIÓN A LA LINEA GERMINAL

    Aquellos usuarios que así lo deseen podrán conservar sus ratones quiméricos en la LPRT para su maduración y cruza con ratones silvestres. Esto con vías a obtener transmisión hacia la línea germinal, logrando generar de este modo, los ratones transgénicos.

    MICROINYECCIÓN PRONUCLEAR DE ADN

    Las políticas de este servicio así como su aplicación serán estudiadas y dadas a conocer mas adelante

    REDERIVACIÓN DE LÍNEAS DE RATONES LIBRES DE PATÓGENOS

    El bioterio del Instituto de Biotecnología de la UNAM determina periódicamente el estado de salud de sus roedores a través de análisis clínicos especializados. La LPRT al estar situada dentro de las instalaciones de este bioterio asegura un ambiente libre de los patógenos que más pueden afectar la experimentación con roedores. Por lo que la LPRT ofrece a los usuarios el servicio de rederivación de cepas o líneas de ratón que se encuentren contaminadas. En este aspecto el usuario debe ponerse en contacto con el técnico encargado para la calendarización de las cruzas con la cepa contaminada a fin de obtener los embriones y su posterior transferencia.

    CRIOPRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE EMBRIONES MURINOS.

    Las políticas de este servicio así como su aplicación serán estudiadas y dadas a conocer mas adelante.

    SERVICIOS MISCELANEOS.

    1. Superovulación
    2. Hembras pseudopreñadas
    3. Colecta de embriones en etapas de preimplantación
    4. Cariotipificación y detección de Mycoplasma sp
    5. Genotipificación por PCR
    6. Cirugías: Ovariectomia, vasectomia y transferencia de embriones

    1. Superovulación.

      Algunas cepas de ratón poseen un bajo índice reproductivo, que va de 5-8 embriones por hembra; tal es el caso de la cepa C57BL/6. Para aquellos usuarios que utilicen desde ovocitos hasta blastocisos, y que deseen aumentar el número de embriones, la LPRT ofrece el servicio de superovulación, que aumenta el número de embriones hasta en un 100%. Este servicio esta disponible para las cepas C57BL/6, ICR (CD1) y BALB/C

    2. Hembras pseudopreñadas.

    3. Estas hembras de ratón han sido apareadas con machos castrados, por lo que se encuentran listas para recibir embriones.

    4. Colecta de embriones en etapas de preimplantación.

      Este servicio incluye la disección, manejo y cuidados de ovocitos y embriones desde una célula hasta en etapa de blastocisto.

    5. Cariotipificación y detección de Mycoplasma sp.

      Rutinariamente la LPRT evaluará tanto el cariotipo como la presencia deMycoplasma sp< en las diferentes líneas que dispone y ofrece. Sin embargo hace disponible este análisis para las líneas del usuario que así lo desee. La cariotipificación se realiza por conteo cromosómico en células tratadas con colcemida. Se evalúan 30 cariotipos diferentes por línea celular. Para la detección de Mycoplasma sp se utiliza el equipo ¨Vernogen Mycoplasma detection kit¨ (Sigma-Aldrich, Cat. MP0025).

    6. Genotipificación por PCR.

      La LPRT ofrece este servicio con el fin de realizar un análisis genético de las líneas de ratones que en la unidad se generen. La LPRT se encargará de colectar las muestras, purificar el ADN genómico, realizar el experimento de PCR y entregar los resultados al usuario. Es responsabilidad del usuario, otorgar a la LPRT los oligonucleótidos cebadores que hayan demostrado funcionar adecuadamente para el análisis por PCR. Este servicio esta supeditado a la disponibilidad de tiempo considerando otras solicitudes que ameriten generación de ratones transgénicos.

    7. Cirugías: Ovariectomía, vasectomía y transferencia de embriones.

      La LPRT pone a disposición del usuario diferentes tipos de cirugías, garantizando un buen procedimiento en general y la sobrevivencia de los individuos.

    COSTOS.

    Los precios de los servicios prestados por la LPRT están siendo calculados y serán dados a conocer a la brevedad posible.

    HORARIO DE SERVICIO.

    De Lunes a Viernes de 9 am a 7 pm de manera directa o electrónicamente en la dirección: david@ibt.unam.mx. Para cualquier duda, aclaración del servicio y asesorías, es necesario establecer contacto a través de esta dirección electrónica o al teléfono 777 190 99 42.

    PROCEDIMIENTOS Y CONDICIONES DE SERVICIO.



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