I. Evolución dirigida de alfa-amilasa para la producción de alquil glucósidos

El presente proyecto pretende hacer uso de técnicas de evolución dirigida para desarrollar un biocatalizador para la producción de alquil glucósidos utilizando la alfa-amilasa de Thermotoga maritima a partir de almidón y alcoholes grasos. Para esto se requerirá el desarrollo de un método que permita detectar las reacciones de alcohólisis sobre un fondo de reacciones de hidrólisis que también son catalizadas por esta enzima. Una vez desarrollado y validado este método se explorarán de manera combinatoria a través de mutagénesis sitio-dirigida varias posiciones de la proteína que se ubican en el sitio de unión al aglicón para lograr por un lado, incrementar el rendimiento de las reacciones de alcohólisis, disminuyendo a su vez el rendimiento de las reacciones de hidrólisis, y por otro, la obtención de enzimas específicas para diferentes alcoholes que se utilicen como aceptores. Las clonas aisladas después de este proceso de introducción de variabilidad/selección que muestren una mayor capacidad alcoholítica, se analizarán a nivel de secuencia de DNA y se expresarán para purificar las enzimas correspondientes y así poder llevar a cabo su caracterización bioquímica para evaluar el rendimiento de la alcohólisis, así como la estabilidad de las enzimas resultantes, tanto a temperatura como a diferentes concentraciones de los diferentes alcoholes utilizados para la reacción de alcohólisis.

II. Estudio del efecto de la topología en el plegamiento de barriles TIM mediante permutación circular

En el presente proyecto se pretende determinar la importancia que tiene la topología para el correcto plegamiento de proteínas con plegamiento de tipo barril TIM, así como identificar las unidades mínimas de plegamiento en este tipo de estructura. El uso de permutaciones circulares permitirá la identificación de subestructuras que de no encontrarse en el contexto del resto de la proteína no tendrían suficiente estabilidad para ser observadas. A diferencia de otros trabajos realizados sobre el tema, nuestra exploración pretende abarcar todos los posibles sitios en que se puede permutar la proteína, incluyendo regiones de estructura secundaria que no han sido explorados. La caracterización cinética del plegamiento de las variantes permutadas de dos proteínas modelo con este tipo de estructura permitirá evaluar el efecto de la topología en la formación y estabilización de enzimas que tienen un plegamiento de barril TIM. Las similitudes o discrepancias entre miembros de esta familia contribuirán a descifrar el origen evolutivo de estas enzimas. Finalmente, la identificación de módulos independientes de plegamiento nos permitirá formar quimeras que sean un punto de origen para generación de librerías que pueden aportar propiedades novedosas ya sea de actividad o de unión a compuestos diversos.